Система автоматизации микроскопа Leica DMi8: пути повышения воспроизводимости научных экспериментов

Leica DMi8 представляет собой инвертированную микроскопическую платформу, специально разработанную для живых клеток, долгосрочного мониторинга и высокопроизводительного скрининга благодаря модульной архитектуре и интегрированной автоматизации. Ключевая отличительная черта — полная моторизация критических компонентов (объективы, предметный столик, диафрагмы, фильтры) в сочетании с программным обеспечением Leica Application Suite (LAS X), которое гарантирует, что каждый экспериментальный протокол воспроизводится идентично от запуска к запуску, минимизируя источники ошибок и дрейфа параметров.

Автоматизированная природа DMi8 критична для многодневных time-lapse экспериментов с живыми культурами, где стабильность условий и отсутствие оператора-введённого шума позволяют добиться публикационного качества данных и надёжных количественных результатов анализа.​

Преимущества моторизованного управления объективами, столиком и освещением

Моторизованный револьвер (6-позиционный кодированный M32) автоматически распознаёт установленный объектив и переключается с точностью <1 мкм, синхронизируя одновременно апертурную диафрагму, напряженность освещения и другие параметры без участия оператора. Это исключает человеческие ошибки при смене увеличений и гарантирует, что контрастность и яркость остаются оптимальными для каждого объектива, что особенно важно в мультиканальной флуоресценции.

Моторизованный столик XY с точностью позиционирования 0,02–0,04 мкм и воспроизводимостью <1 мкм позволяет программировать комплексные траектории сканирования: спирали для поиска областей интереса, матрицы полей для мультилуночных планшетов или специфические точки для долгосрочного отслеживания клеток. Автоматический поиск образца (Automated Sample Finder) в считанные секунды сканирует всю подготовку в низком увеличении, создавая карту поля и автоматически переходя к интересующим регионам на высоком разрешении.

Z-моторизация (фокусировка) с замкнутым контуром обеспечивает повторяемость лучше чем 20 нм при многократных позиционированиях, что критично для конфокальной или структурированной освещения, где глубина фокуса ограничена. Для живых клеток включена адаптивная система контроля фокуса (Adaptive Focus Control, AFC), которая отслеживает дрейф Z на протяжении часов и дней, регулируя фокус автоматически, чтобы образцы оставались в резкости при естественном движении клеток и прогибании посуды.

Система управления освещением Intensity Manager автоматически корректирует яркость LED при смене объективов, анализируя гистограмму по пикселям и поддерживая оптимальное соотношение сигнал-шум. Результат: воспроизводимые условия съёмки, исключение передержки (saturation) и недодержки (underexposure) в серийных измерениях, что позволяет эффективно использовать количественные методы анализа.

Настройка и программирование автоматизированных протоколов

LAS X software — сердце DMi8, предлагающее визуальный редактор экспериментов (Experiment Designer), где пользователь описывает последовательность действий: выбрать позицию → сфокусироваться → захватить 3 канала → подождать 15 мин → повторить 100 раз. Каждый шаг может быть условлен предыдущим (например, если брайтфилд показывает мертвые клетки, пропустить флуоресценцию), что обеспечивает интеллектуальное использование времени сканирования.

Navigator модуль (расширенная версия LAS X) позволяет загрузить макет мультилуночного планшета и автоматически настроить сетку позиций, избегая вручную устанавливать координаты для 96 скважин. Для захвата стека Z: определяются верхний и нижний объем, система самостоятельно вычисляет оптимальный шаг (часто 0,5–2 мкм), и весь стек захватывается без прерванных команд.

Для приобретения системы Leica DMi8 с полным автоматизационным набором (моторизованные столик, объективы, камера, инкубационная камера), компания Microscope One осуществляет подбор под специфические биологические применения, выполняет установку, калибровку протоколов и обучение персонала, обеспечивая минимальное время на пуск в производство.

Практические приёмы написания протоколов:

• Шаблоны (Templates) для типовых образцов: 35-мм чашка, 24-луночный планшет, слайд с покровным стеклом.
• Sequencer (LAS X Synapse) для микросекундной синхронизации, если требуется триггер внешних устройств (стимуляция, лазер, оптогенетика).
• Макросы с логикой (IF–THEN): например, если средний блеск < 50%, повторить фокусировку, иначе рискнуть и перейти на следующую позицию.

Контроль температуры и газовых условий в инкубационной камере

Окружающая среда на этапе in-vivo imaging часто становится ограничивающим фактором: клетки умирают при холоде, испаряется среда, конденсат смазывает оптику. DMi8 интегрируется с модульными инкубационными системами (OkoLab Cage Incubator, Leica Heating Frame 2000), обеспечивающими:

• Температура: 37 °C ± 0.1 °C точностью (диапазон 3 °C выше комнатной до 45 °C). Два бесшумных нагревателя с рециркуляцией горячего воздуха предотвращают локальные горячие пятна, которые повредили бы клетки.
• CO₂: 0–20% с точностью ± 0.1%, что критично для буферинга pH среды и поддержания гомеостаза. Двойной датчик NDIR (не зависит от влажности) работает 10 лет без обслуживания.
• O₂: опционально 0–95%, для гипоксических или нормоксических условий (опция H203-T-H-CO2-O2). Позволяет моделировать ишемию в экспериментах по восстановлению.​
• Влажность: встроенный модуль Vibration Free Humidifying с мембраной, препятствующей конденсату и испарению среды в течение 24+ часов.

Система может управляться как по температуре образца (внешний датчик), так и по внутренней камере (обычно выбирают образец для реальной работы). Интеграция с LAS X позволяет задавать температурные рампы (например, нагревание на 1 °C/мин для исследования терморезистентности).

Документирование и сохранение параметров для серийных измерений

Leica DMi8 с LAS X ведёт полный журнал метаданных: дата–время, оператор, объектив, увеличение, цифровой зум, экспозиция, усиление (gain), лазерная мощность (если FL), конденсор, температура инкубатора, CO₂ на момент съёмки, и т.д. Каждое изображение сохраняется в OME-TIFF (открытый стандарт), что гарантирует долгосрочную читаемость и совместимость с анализом в Fiji, MATLAB или специализированном ПО.

Воспроизведение протоколов: сохранённый .exp-файл (эксперимент) может быть переиспользован дни, недели или годы спустя, и система автоматически восстановит все параметры, включая позиции на столике (память координат), фильтры и диафрагмы. Это критично для лонгитюдных исследований, когда нужно отследить один и тот же регион образца в разные моменты времени с идентичной геометрией съёмки.

Статистика экспериментов: LAS X генерирует резюме протокола (дата старта, продолжительность, количество захватов, объём памяти, ошибки фокусировки, если были), которое можно экспортировать в PDF или Excel для отчётов и публикаций. Экспорт данных в CSV позволяет быстро интегрировать количественные результаты (средние интенсивности, распределение флуоресценции по ячейкам) в статистический анализ (GraphPad Prism, R).

Валидация воспроизводимости: система может запустить идентичный протокол несколько раз на одной и той же подготовке (или на разных подготовках) и сравнить параметры съёмки (включая вычисляемые сигналы, такие как colocalization или temporal trends); наличие артефактов или дрейфа параметров легко выявляется.

С уважением,

Популярная медицина

Комментируйте ВКонтакте